Влияние комплекса поверхностно-активных веществ и витаминов на формирование иммунного ответа

Ветеринария №4 2003 г

С.А. Староверов, В.А. Сидоркин, С.В. Семенов

Среди средств, используемых для регуляции иммунитета, как при иммунизации, так и при терапии большое внимание уделяется биологически активным веществам. К ним, в ряде случаев, относят нуклеиновые кислоты [1], иммуномодуляторы продуцируемые микроорганизмами [2], витамины и микроэлементы [3, 6].
Кроме того, при лечении бактериальных инфекций сочетание иммуномодуляторов с антибиотиками повышает их терапевтическое действие [4].
Так, например, имеются данные о том, что использование иммуномодулятора металлоорганической природы приводит к изменению чувствительности мышей к чумному токсину за счет включения механизмов неспецифической защиты [5]. Однако многие вопросы, связанные с изучением механизмов действия биологически активных веществ остаются открытыми.

Материалы и методы
Целью нашей работы послужило изучение влияния воднодисперсных эмульсий на факторы клеточного и неспецифического иммунитета.

Реакцию бласттрасформации проводили по методике, описанной О. Новелом (1960 г).
Для этого по общепринятой методике выделяли лимфоциты из цельной бараньей крови [7]. Затем их культивировали в 100 мкл культуральной среды с добавлением 0,1% исследуемого раствора. В качестве митогенов использовали фитогемагглютинин (ФГА) «Реахим» Чехия и липополисахарид (ЛПС) из Psevdomonas aerogenosa. В качестве исследуемых растворителей применяли 20% водный раствор кремофора EL (оксиэтилированное касторовое масло), 5% водную эмульсию витамина Е в 20% растворе кремофора EL, препарат «Нитамин», разработанный ЗАО «Нита-фарм» ( 5% витамина Е, 3% витамина, А, 0,125% витамина Д, 10% витамина С).

Изучение влияния растворителей на фагоцитоз проводили на макрофагах, выделенных из парентеральной полости мышей линии BALB С. Выделение парентеральных макрофагов осуществляли по общепринятой методике [7]. Выделенные клетки разводили до концентрации 4х106 /мл и культивировали 2 мл взвеси макрофагов с 0,1% взвеси растворителя для вакцин в течение 30 минут при 370С. Затем в каждую пробирку вносили по 0,1 мл 1 млрд. взвеси золотистого стаффилакокка из штамма 209-Р и полученную взвесь повторно культивировали при тех же режимах. После окончания сроков культивирования из каждой пробирки готовили мазки, фиксировали их метанолом, окрашивали по Романовскому-Гимзе и проводили микроскопию. Определяли фагоцитарную активность и интенсивность макрофагов. Влияния растворителей на бактерицидную активность макрофагов определяли в НСТ-тесте по общепринятой методике [7].

 Изучение неспецифических факторов иммунитета осуществляли на половозрелых крысах (самках), подобранных по методу аналогов. Животным внутримышечно вводили смесь бычьего сывороточного альбумина (БСА) с исследуемым растворителем. Животным вводили 100 мкл раствора, содержащего 30 мкг БСА. Через 10 дней после второй, третьей и четвертой иммунизации у подопытных животных производили отбор проб крови и оценивали факторы естественной клеточной и гуморальной резистенции.

Тесты, определяющие функциональную и бактерицидную активность фагоцитов, содержание в сыворотке лизоцима и комплемента проводили по общепринятым методикам (Пастер и др., 1989).

Результаты и обсуждение
В результате исследований установлено, что добавление кремофора к культуре лимфоцитов приводит к увеличению образования бластоподобных форм лимфоцитов в случае использования в качестве митогена ФГА на 20%, а ЛПС – на 14%. Добавление к кремофору витамина Е приводит к усилению реакции бласттрансформации на 30,7 и 23% соответственно. Добавление к культуре препарата «Нитамин» приводило к угнетению реакции бласттрансформации и вызывало снижение количества бластоподобных клеток на 5,6 и 24% соответственно (таблица 1). 

Таблица 1. Результаты реакции бласттрансформации
Прописи лекарственных форм.
Использование ФГА в качестве митогена, (%).
Использование ЛПС в качестве митогена, (%) 

Кремофор EL
79,3±0,5
80,6±0,5

Кремофор EL +витамин Е
90±0,5
89,6±0,5

Нитамин
53,6±0,4
42,6±0,4

Контроль 1 с митогеном
59,3±0,4
66,6±0,4

Контроль 2 без митогена
12,6±0,4
14,3±0,4

При изучении влияния растворителей на фагоцитарную реакцию парентеральных макрофагов установлено, что использование в качестве растворителя 20% раствора кремофора приводит к повышению их фагоцитарной активности до 16,6?0,5 ед. с одновременным снижением фагоцитарной интенсивности до 0,5?0,05 ед. Добавление к раствору кремофора 5% витамина Е вызывает более интенсивное повышение их фагоцитарной активности (31,7?0,5 ед.) и интенсивности (2,3?0,047 ед.). Препарат «Нитамин» также приводит к активации фагоцитарной активности и интенсивности, но, по-видимому, присутствие витаминов А и Д вызывает определенное угнетение реакции (таблица 2).

Таблица 2. Показатели функциональной активности макрофагов
Прописи лекарственных форм.
Показатели фагоцитарной активности макрофагов
Показатели фагоцитарной интенсивности макрофагов

Кремофор EL
16,6±0,5
0,5±0,005

Кремофор EL +витамин Е
31,7±0,5
2,3±0,0047

Нитамин
20,6±0,4
1,04±0,031

Контроль
14,6±0,4
0,905±0,005

При применении воднодисперсионной формы кремофора нами отмечалось повышение бактерицидной активности парентеральных макрофагов до 12,4 ед. Добавление к кремофору витамина Е повышало бактерицидную активность макрофагов на 20 ед., а внесение в среду культивирования препарата «Нитамин» на 8,6 ед. (таблица 3).
Таблица 3. Изучение бактерицидной реакции макрофагов в тесте с нитротетразолевым синим
Прописи лекарственных форм.
Показатели бактерицидной активности макрофагов 

Кремофор EL
12,4±0,4

Кремофор EL +витамин Е
32±0,5

Нитамин
21,2±0,7

Анализируя результаты исследований, приведенные в таблице 4, хочется отметить, что при иммунизации комплексом нитамин с растворенным в нем БСА происходит повышение титра антител к БСА в два раза по сравнению с ПАФ и мицеллярными структурами и в четыре раза по сравнению с физиологическим раствором.

Таблица 4. Результаты иммунизации крыс
Название препарата
2 иммунизация
3 иммунизация
4 иммунизация 

Водно-дисперстный раствор, вит. Е+БСА
1:128
1:5120
1:10240

Водно-дисперстный раствор+БСА
1:128
1:2560
1:5120

ПАФ+БСА
1:128
1:2560
1:5120

Физ.р-р+БСА
1:128
1: 1280
1:2560

При рассмотрении влияния растворителей на бактерицидную активность сыворотки крови отмечено небольшое повышение бактерицидной активности сыворотки крови у крыс, иммунизированных комплексом БСА - мицеллы - витамин Е. Однако, в дальнейшем бактерицидная активность выравнивается у всех иммунизированных групп животных, что связано с нормальной реакцией организма на введение антигена (рис 1).

При исследовании концентрации сывороточного лизоцима в крови нами фиксировалось его значительное увеличение после второй иммунизации (рис. 2). Однако концентрация лизоцима в дальнейшем снижается и остается практически на одном уровне во всех случаях.

Рисунок 1. Результаты исследования бактерицидной активности сыворотки крови крыс.
Рисунок 2. Результаты исследования концентрации сывороточного лизоцима в сыворотки крови крыс.

При определении активности комплемента нами были получены следующие результаты. После второй иммунизации комплексом мицеллы витамин Е с БСА активность комплемента составляла 77,6 ус.ед./мл, мицеллами с БСА 53 ус.ед./мл, ПАФ с БСА 77,6 ус.ед./мл, физиологическим раствором с БСА 46,5 ус.ед./мл. После третьей иммунизации активность комплемента составляла 60 ус.ед./мл, 50 ус.ед./мл, ПАФ с БСА 65 ус.ед./мл, 45 ус.ед./мл соответственно. Четвертая иммунизация не привела к существенному изменению уровня комплемента в крови и он составил 60, 45, 50 и 30 ус.ед./мл соответственно.

Заключение
Комплексы поверхностно-активных веществ и витаминов способствуют усилению иммунного ответа организма, что говорит об их иммуностимулирующем действии. Однако, препарат «Нитамин» приводит к незначительному угнетению реакции бласттрансформации in vitro, что, по-видимому, связано с присутствием в его составе витаминов Д3 и А. Кроме того, данные растворители обладают адьювантными свойствами.

Литература
1. Земсков В.М., Земсков А.М. // Тез. конф. Актуальные вопросы иммуноформакологии. Москва.-1987.-С.23-27.
2. Хурнова Л.М., Иваницкая Л.П. и др. // Антибиотики и медицинская биотехнология.-1987.-№11.-С.814-816.
3. Кудрин А.В., Скальный А.В. и др. // Иммунофармокология микроэлементов.-2000.- КМК «Москва».
4. Кынина С.Е. // Микробиологический журнал.-1994.-Т.56.-№1.-С.75.
5. Кирилличева Г.Б., Батурина И.Г. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-1993.-№3.-С.282-284.
6. Трушина Э.Н., Карагодина З.В. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-1995.-№3.-С.317-319.
7. Пастер Е.У., Овод В.В. // Иммунология пракикум.-1989.-«Высшая школы».-Киев.